Vloeisitometrie is 'n sitologiese navorsingsmetode wat gebruik word vir in-diepte ontleding van selle. Die voordeel daarvan is dat dit jou toelaat om elke sel individueel te bestudeer. Hierdie tipe analise help om verskeie parameters in honderde selle binne 'n kwessie van sekondes te evalueer. Gevolglik word sitofluorimetrie beskou as een van die vinnigste en mees akkurate metodes van analise wat tans beskikbaar is vir wetenskaplikes en klinici.
Beginsel
Die beginsel van vloeisitometrie is gebaseer op die meting van ligverstrooiing en luminesensie (fluoressensie) van selle. Die selsuspensie word as 'n stroom teen hoë spoed deur die sitometersel gevoer, waar dit met 'n laser bestraal word. Die sogenaamde hidrodinamiese fokusering word ook daar uitgevoer. Die meganisme daarvan is dat die vloei van die sel met die bestudeerde deeltjies by die uitlaat in die eksterne straal vloei, wat 'n hoër spoed het. As gevolg hiervan word deeltjies in 'n geordende ketting in lyn gebring.
Voorselle is gemerk met spesiale fluoresserende kleurstowwe (fluorochrome). Danksy hulle, die laserstraalwek 'n sekondêre gloed op. Die ontvangde ligseine word deur detektors geregistreer. Vervolgens word die inligting verwerk deur sagteware-algoritmes te gebruik wat jou toelaat om individuele selpopulasies te tel wat in sekere kriteria verskil.
Navorsing met konvensionele mikroskopie slaag dikwels nie daarin om tussen verskillende selle te onderskei nie omdat hulle dieselfde lyk. Sitofluorimetrie kan ander data verskaf (DNA-struktuurintegriteit), proteïenuitdrukking analiseer, seloorlewing.
Aangesien opwekking van fluorochrome ligstrale met verskillende golflengtes vereis, sowel as verskillende soorte detektors, is moderne installasies toegerus met verskeie opsporingskanale (van 4 tot 30). Die aantal laserstralers kan van 1 tot 7 wees. Meer komplekse toestelle laat multiparameterstudies van verskeie eienskappe van deeltjies gelyktydig toe.
Voordele en nadele
Die voordele van vloeisitometrie sluit in:
- hoë verwerkingspoed (registrasie van tot 30 duisend gebeurtenisse in 1 sekonde);
- moontlikheid om 'n groot aantal selle te bestudeer (tot 100 miljoen in 'n monster);
- Kwantifisering van die intensiteit van fluoresserende lig;
- analise van elke sel;
- gelyktydige studie van heterogene prosesse;
- outomatiese skeiding van data deur selpopulasies;
- kwaliteitvisualisering van resultate.
Nog 'n kenmerk van hierdie tegnologie is ditdie geanaliseerde deeltjie kan met verskeie fluoresserende oplossings gekleur word. Danksy dit vind 'n multi-parameter studie plaas.
Die nadele sluit in die kompleksiteit van die tegniese toerusting en die behoefte aan spesiale monstervoorbereiding.
Sitometers
Die eerste toestelle van hierdie tipe het reeds in 1968 in Duitsland verskyn, maar hulle het baie later wydverspreid geraak. Tans kan alle toestelle wat volgens die metode van vloeisitometrie werk in 2 tipes verdeel word:
- toestelle wat fluoresserende straling (twee of meer golflengtes), 10° en 90° ligverstrooiing (laehoek- en syverstrooiingsdetektor) meet);
- toestelle wat, benewens die meting van verskeie sellulêre parameters, outomaties volgens hierdie kriteria in groepe sorteer.
Die voorwaartse strooidetektor is ontwerp om die grootte van die sel te bepaal, en die systrooitoestel laat jou toe om inligting oor die teenwoordigheid van intrasellulêre korrels, die volumeverhouding van die sitoplasma en die kern te verkry.
Klassieke sitometers, anders as ligmikroskope, laat nie toe om 'n beeld van 'n sel te verkry nie. In onlangse jare is gekombineerde toestelle egter ontwikkel wat die vermoëns van 'n mikroskoop en 'n sitofluorimeter kan kombineer. Hulle sal hieronder bespreek word.
Beeldingssitometers
Vir instrumente wat in klassieke vloeisitometrie gebruik word,een kenmerk is kenmerkend: as seldsame gebeurtenisse in die populasie van geanaliseerde selle geregistreer word, dan is daar geen manier om te bepaal wat hul essensie is nie. Hierdie deeltjies kan óf die oorblyfsels van dooie selle óf 'n seldsame groep daarvan wees. In konvensionele toestelle word sulke data uitgesluit van die algemene vloei van gebeure, maar dit is hulle wat van besondere waarde vir wetenskaplike en kliniese analise kan wees.
Die nuwe generasie beeldvloeisitometers laat jou toe om 'n beeld vas te vang van elke sel wat in die vloei deur die detektorsone beweeg. Dit is maklik om dit te sien deur op die ooreenstemmende area van die diagram te klik, wat op die rekenaarmonitor vertoon word.
Aansoekgebiede
Vloeisitometrie is 'n universele metode wat in baie velde van medisyne en wetenskap gebruik word:
- immunologie;
- onkologie;
- oorplanting (oorplanting van rooi beenmurg, stamselle);
- hematologie;
- toxicology;
- biochemie (meting van suurheid binne die sel, die studie van ander parameters);
- farmakologie (skep nuwe medisyne);
- mikrobiologie;
- parasitologie en virologie;
- oseanologie (die studie van fitoplankton om die toestand van waterliggame en ander take te bepaal);
- nanotegnologie en mikropartikelanalise.
Immunologie
Die menslike immuunstelsel bestaan uit 'n wye verskeidenheid selle. Vloeisitometrie in immunologie maak dit moontlik om hul struktuur en funksies te evalueer, dit wil sê om morfofunksioneleontleding.
Sulke navorsing help om die komplekse aard van immuniteit te verstaan. Selfenotipes verander as gevolg van aktivering deur antigene, die ontwikkeling van patologieë en ander faktore. Sitofluorometrie kan subpopulasies van immuunselle in 'n komplekse mengsel skei en al hul veranderinge oor tyd evalueer.
Onkologie
Een van die belangrikste take in onkologie is die differensiasie van selle volgens hul tipe. Die beginsel van ontleding deur vloeisitometrie in onkohematologie is gebaseer op die volgende verskynsel: wanneer 'n monster met 'n spesiale fluoresserende kleurstof behandel word, bind dit aan sitoplasmiese proteïene. Na deling in aktief prolifererende selle, verminder die inhoud daarvan met die helfte. Gevolglik neem die intensiteit van selluminessensie tweevoudig af.
Daar is ander maniere om prolifererende selle op te spoor:
- gebruik van DNA-bindende kleurstowwe (propidiumjodied);
- gebruik van gemerkte uracil;
- registrasie van 'n verhoogde vlak van uitdrukking van siklienproteïene, wat betrokke is by die regulering van die selsiklus.
