Chromatografie is een van die metodes om stowwe te skei. Dit word gebruik vir daaropvolgende kwalitatiewe en kwantitatiewe ontleding van die fisiese en chemiese eienskappe van mikropartikels. 'n Variasie van hierdie tegnologie is affiniteitschromatografie. Die idee om proteïenverbindings te onderskei deur die eienskap van molekulêre affiniteit te gebruik, is al etlike dekades in die wetenskap bekend. Dit het egter eers in onlangse jare sy ontwikkeling ontvang, na die bekendstelling van hoogs poreuse hidrofiliese materiale wat as 'n matriks gebruik word. Hierdie metode laat toe om beide analitiese probleme (skeiding van stowwe en hul identifikasie) en voorbereidingsprobleme (suiwering, konsentrasie) op te los.
Essence
Affiniteitschromatografie (van die Latynse woord affinis - "aangrensend", "verwant") is gebaseer op affiniteitsinteraksies, wat die vorming van hoogs spesifieke bindings tussen 'n spasieermolekule (ligand of affinant) en 'n teikenmolekule is. Hierdie meganismes is wydverspreid van aard (verbinding van mediators of hormone en reseptore, teenliggaampies enantigene, hibridisasie van polinukleotiede en ander tipes prosesse). In medisyne word affiniteitschromatografie sedert 1951 vir praktiese doeleindes gebruik
Die komponente word soos volg geskei:
- werkoplossing wat die stof bevat wat geïsoleer moet word, word deur die sorbens gevoer;
- ligand wat op die sorberende matriks neergelê word, behou hierdie stof;
- dit is gekonsentreer (ophoping);
- ekstraksie van die geïsoleerde stof uit die sorbent deur te was met 'n oplosmiddel.
Hierdie metode laat jou toe om hele selle te isoleer. Die verskil van tradisionele sorpsie-chromatografie is dat daar 'n sterk biospesifieke binding van die geïsoleerde komponent aan die sorbent is, wat gekenmerk word deur hoë selektiwiteit.
Adsorbents
Die volgende stowwe word as adsorberende middels gebruik:
- Jelverbindings gebaseer op agarose, 'n polisakkaried wat uit agar verkry word. Die mees algemene gebruik is 3 variëteite: sepharose 4B, CL (kruisgebonde agarose) en affi-gel. Laasgenoemde samestelling is 'n gemodifiseerde gel van agarose en poliakrielamied. Dit het groter biologiese traagheid, hoë chemiese en termiese weerstand.
- Silika (silikagel).
- Glas.
- Organiese polimere.
Om meganiese struikelblokke tydens ligandkontak uit te skakel, word bykomende stowwe gebruik om dit van die draer te skei (peptiede, diamiene, poliamiene, oligosakkariede).
toerusting
Affiniteit-chromatografie-toerusting sluit die volgende hoofeenhede in:
- opgaartenks vir die mobiele fase (eluent);
- hoëdrukpompe vir mediumtoevoer (meestal resiprokerend);
- filter vir die skoonmaak van eluente van stof;
- doseertoestel;
- chromatografiese kolom vir mengselskeiding;
- verklikker vir die opsporing van geskeide komponente wat die kolom verlaat;
- chromatogramopnemers en mikroverwerkereenheid (rekenaar).
Om die hoeveelheid opgeloste lug te verminder, word helium eers deur die mobiele fase gevoer. Om die konsentrasie van die eluent te verander, word verskeie pompe wat deur die programmeerder beheer word geïnstalleer. Chromatografiese kolomme is gemaak van vlekvrye staal (vir verhoogde vereistes vir korrosiebestandheid), glas (universele opsie) of akriel. Vir voorbereidingsdoeleindes kan hul deursnee wissel van 2 tot 70 cm. In analitiese chromatografie word mikrokolomme Ø10-150 µm gebruik.
Om die sensitiwiteit van die detektors te verhoog, word reagense in die mengsel ingebring, wat bydra tot die vorming van stowwe wat meer strale in die ultraviolet of sigbare gebied van die spektrum absorbeer.
Metode
Daar is 2 hooftipes vloeistof-affiniteitschromatografie:
- Kolom, waarin die kolom gevul is met 'n stilstaande fase en 'n mengsel met 'n vloei daardeur gevoer wordeluent. Skeiding kan onder druk of onder swaartekrag plaasvind.
- Dun laag. Die eluent beweeg langs die plat adsorberende laag onder die invloed van kapillêre kragte. Die adsorbent word op 'n glasplaat, keramiek- of kwartsstaaf, metaalfoelie, toegedien.
Hoofstadia van werk sluit in:
- voorbereiding van die adsorbens, fiksasie van die ligand op die draer;
- voeding van die skeidingsmengsel na die chromatografiese kolom;
- mobiele fase-laai, komponentbinding deur ligand;
- fasevervanging om die gebonde stof te isoleer.
Bestemming
Affiniteitschromatografie word gebruik om die volgende tipes stowwe te isoleer (die tipe ligand wat gebruik word word tussen hakies aangedui):
- analoë van ensiematiese inhibeerders, substrate en kofaktore (ensieme);
- bio-organiese stowwe met tekens van genetiese vreemdelingskap, virusse en selle (teenliggaampies);
- hoë molekulêre gewig koolhidrate, monosakkaried polimere, glikoproteïene (lektiene);
- kernproteïene, nukleotidieltransferases (nukleïensure);
- reseptore, vervoerproteïene (vitamiene, hormone);
- proteïene in wisselwerking met selmembrane (selle).
Hierdie tegnologie word ook gebruik om geïmmobiliseerde ensieme te verkry, en binding daarvan aan sellulose laat die produksie van immunosorbente toe.
Chromatografie van DNA-bindende proteïene
Isolasie van DNA-bindende proteïene word uitgevoer met behulp vanheparien. Hierdie glikosaminoglikaan is in staat om 'n wye reeks molekules te bind. Affiniteitschromatografie van proteïene van hierdie groep word gebruik om stowwe soos:te isoleer
- faktore van aanvang en verlenging van translasie (sintese van nukleïensuurmolekules en proteïene);
- beperkases (ensieme wat sekere volgordes in dubbelstring-DNS herken);
- DNA-ligases en polimerases (ensieme wat die binding van twee molekules kataliseer om 'n nuwe chemiese binding te vorm en betrokke is by DNA-replikasie);
- serienprotease-inhibeerders wat 'n belangrike rol speel in immuun- en inflammatoriese prosesse;
- groeifaktore: fibroblast, Schwann, endoteel;
- proteïene van ekstrasellulêre matriks;
- hormoonreseptore;
- lipoproteïene.
Dignity
Hierdie metode is een van die mees spesifieke vir die isolasie van reaktiewe verbindings (ensieme en groter aggregate - virusse). Dit word egter nie net gebruik om biologies aktiewe stowwe te isoleer nie.
Opsporing van teenliggaampies in klein hoeveelhede, kwantitatiewe assessering van poliadielsuur, vinnige bepaling van die molekulêre massas van dehidrogenases, verwydering van sekere besoedelingstowwe, studie van die kinetika van aktivering van die onaktiewe vorm van tripsien, die molekulêre struktuur van die mens interferone - dit is nie die hele lys van studies waarin affiniteit gebruik word nie chromatografie. Die gebruik in die kliniek is te danke aan die voordele daarvan soos:
- Doeltreffende skoonmaakvermoëproteïene, polisakkariede, nukleïensure. Hulle verskil effens in hul fisiese en chemiese eienskappe en verloor aktiwiteit tydens hidrolise, denaturering en ander tipes behandeling wat in ander metodes gebruik word.
- Die spoed van skeiding van stowwe, die dinamiese aard van die proses.
- Geen spesiale ensiemsuiwering en isoënsiemhomogenisering nodig om dissosiasiekonstantes te bepaal nie.
- In staat om 'n wye reeks stowwe te skei.
- Lae verbruik van ligande.
- Moontlikheid van skeiding van stowwe in groot volumes.
- Omkeerbare proses van binding van biologiese makromolekules.
Hierdie tegniek kan met ander gekombineer word om 'n bykomende veld (gravitasie, elektromagneties) op te lê. Dit laat jou toe om die tegniese vermoëns van chromatografie uit te brei.
Ensimatiese ingenieurswese
Danksy hierdie metode het die aktiewe ontwikkeling van 'n nuwe tak van biotegnologie – ensiemingenieurswese – begin.
Affiniteitschromatografie vir ensiemisolasie het die volgende voordele:
- verkryging van ensieme in groot hoeveelhede as gevolg van minder tyd, as gevolg daarvan - hul verlaging in prys;
- immobilisering van ensieme kan die omvang van hul toepassing in medisyne en industrie aansienlik uitbrei;
- Die assosiasie van ensieme met 'n onoplosbare vaste ondersteuning maak dit moontlik om die invloed van die mikro-omgewing en die rigting van reaksies, wat 'n belangrike rol in natuurlike en fisiologiese prosesse speel, te bestudeer.
