PCR, of polimerase-kettingreaksie, is 'n gesofistikeerde laboratoriumtegniek wat wyd in medisyne en ander wetenskaplike velde gebruik word. PCR-diagnostiek het op 'n tyd 'n ware deurbraak in die wetenskap geword.
Beskrywing
Kwantitatiewe PCR is 'n tipe intydse PCR.
Dit word verstaan as 'n variant van PCR, waarin die kinetika van die reaksie voortdurend aangeteken word, wat dit moontlik maak om die inhoud van spesifieke DNA-nukleotiedvolgordes in 'n komplekse molekulêre mengsel kwalitatief te evalueer.
Kwantitatiewe PCR-metode sal hieronder in meer besonderhede bespreek word.
Die kern van die ontleding
Kulturele en serologiese metodes word veral dikwels gebruik om infeksies te diagnoseer. Onder die eerste word teenliggaampies teen 'n aansteeklike patogeen in die bloedserum bepaal. In die tweede word biologiese materiaal wat van 'n siek persoon geneem is, gebruik om 'n spesifieke medium te saai wat gunstig is vir die groei van patogeenkolonies. Diagnostiek in beidesaak kan dae of weke duur.
PCR-ondersoek kan uitgevoer word met verskillende biologiese materiale wat van 'n siek persoon verkry word. Bloed en ander patologiese, fisiologiese en biologiese media en vloeistowwe dien as monsters. Jy kan PCR ontlasting of urine doen.
Atipiese en virale infeksies word meestal deur kwantitatiewe PCR gediagnoseer, aangesien dit dalk nie maklik is om te diagnoseer nie as gevolg van die spesifieke aard van die patologiese proses wat hulle veroorsaak. Om sulke infeksies te bepaal, neem dit tyd, waartydens teenliggaampies in die liggaam begin geproduseer word, bepaal deur serologiese metodes. Maar dit is in sommige gevalle onaanvaarbaar.
Uitvoermetode
PCR-metode - laboratoriumopsporing van infeksie in monsters wat van die pasiënt geïsoleer is (in vitro).
Om 'n polimerase-kettingreaksie uit te voer, word 'n stel spesiale reagense benodig.
Die toetsmateriaal word met reagense in proefbuise ingebring. Die proefbuise word in 'n spesiale apparaat geplaas - 'n PCR-versterker, wat ontwerp is om die verlangde RNA- of DNA-fragmente te versterk (vermeerder) en die PCR-versterker werk in 'n sikliese modus. In enige siklus, as die monsters die RNA- of DNA-volgorde van die patogeen bevat, versamel meer en meer kopieë van die deeltjies van hierdie nukleïensure in die oplossing. Jy kan die teenwoordigheid van die patogeen en die hoeveelheid daarvan in die monsters bepaal.
tipes PCR
Kwalitatiewe analise deur PCR laat jou toe om die volgende resultaat te kry:
- negatief wanneer die patogeen van belang nie in die monsters gevind word nie;
- positief as volgordes in die monsters gevind word wat kenmerkend is van 'n bepaalde patogeen.
Met 'n positiewe PCR-resultaat kan ons met 95% akkuraatheid praat oor die teenwoordigheid van 'n gediagnoseerde infeksie. Terselfdertyd bereik die akkuraatheid van PCR-stelle wat vir diagnostiese doeleindes gebruik word 100%.
Gewoonlik word 5% van verkeerde resultate deur die menslike faktor bepaal. Byvoorbeeld, oortredings van die tegniek van ontleding en berging van reagense kan die akkuraatheid van die studie aansienlik verminder.
Kwantitatiewe PCR definieer die konsep van virale lading. Dit is moontlik om te bepaal hoeveel stelle patogeen-DNS in die monsters was wat van die pasiënt geneem is.
Die erns van die infeksie is direk eweredig aan die toename in hul aantal. Jy kan ook die sukses van terapie bepaal om die virale lading te verminder.
Indiening vir PCR-biomateriaal
Kwantitatiewe PCR word in die kliniek uitgevoer, hoofsaaklik in die oggend. Tydens 'n besoek aan die dokter sal die pasiënt vertel word wat geneem moet word: skraap, smere, urine of bloed. PCR kan patogene opspoor ongeag die vlak van kontaminasie van die materiaal.
Vir 'n positiewe ontleding, in teorie, word die teenwoordigheid van slegs een patogeen in die monsters vereis. In die praktyk probeer hulle om nog gunstiger toestande te skep. Daar is 'n paar aanbevelings hiervoor:
- as hulle 'n skraap of depper van die geslagsdele neemorgane, moet jy drie dae voor die studie van intieme omgang weerhou;
- jy kan nie met antibakteriese middels spoel of jouself voor die ontleding was nie;
- drie uur voordat jy 'n smeer van die uretra neem, moet jy geduldig wees en nie jou ingewande leegmaak nie.
Moenie hierdie reëls volg wanneer jy bloed skenk nie.
Hoe word die resultate van kwantitatiewe PCR-analise geïnterpreteer?
Kwantitatiewe evaluering van die resultate wat verkry is
In 'n aantal kliniese situasies kom die probleem van die doeltreffendheid van die behandeling en/of die dinamika van die patologieproses voor. Sulke vrae is veral relevant wanneer mense met chroniese infeksies (menslike immuniteitsgebreksvirus, hepatitis B en C) ondersoek word. By die diagnose is dit gebaseer op die feit dat die ophoping van amplikone (PCR-produkte) eweredig is aan die teenwoordigheid van kopieë van die verlangde geen in die geanaliseerde monster.
Natuurlik, met inagneming van die resultate van kwantitatiewe PCR word gedoen deur gelelektroforese met die studie van die intensiteit van spesiale PCR-seine. 'n Voorvereiste vir 'n korrekte kwantitatiewe beoordeling van die resultate wat verkry is, is ook positiewe betroubare kontrolemonsters wat 'n bekende aantal kopieë van die verlangde geen bevat (byvoorbeeld duisend kopieë van die hepatitis C-geen vir een PCR-reaksie). Verskeie reeksverdunnings van die kwantitatiewe kontrole laat kalibrasiekrommes toe om gegenereer te word en word gebruik om die inhoud van kliniese genokopieë in kliniese monsters te evalueer.
In die definisie van kwantitatiewe PCR, was 'n sleutelprestasie die skeppingfluoresserende DNA-probes wat gelyktydig met eenvoudige primers by die reaksiemengsel gevoeg word en jou toelaat om die PCR-proses betyds na te spoor, dit wil sê intydse PCR.
Die TaqMan-metodologie verwys na die sintese van fluoresserende DNA-probes wat spesifiek vir die middelste deel van die amplikon is en twee byskrifte aan die punte het. Een daarvan is 'n fluoresserende etiket, die tweede is 'n blusmolekule vir hierdie fluoressensie.
'n Spesiale toestel, wat 'n baster van 'n fluorimeter en 'n termoblok-versterker is, doen konstante metings van fluoressensie in elke proefbuis (intydse PCR-beginsel). Na 20-40 siklusse van PCR, sal individuele kurwes vir elke monster verkry word. Die aantal kopieë van die verlangde geen wat in die toetsmonster vervat is, kan uit kalibrasiekurwes met kontrolemonsters bereken word.
'n Belangrike kenmerk van die implementering van PCR deur die fluoresserende metode is ook dat dit nie nodig is om buise met 'n PCR-mengsel oop te maak wanneer die resultate in ag geneem word nie. Dit verminder die moontlikheid van kamerkontaminasie met amplifikasieprodukte, en dit is nie nodig om spesiale werkareas vir elektroforese toe te ken nie.
Wat wys 'n kwantitatiewe PCR-transkripsie?
Wat word ontdek?
Deur 'n metode soos kwantitatiewe PCR, word kwalitatiewe veranderinge in gene gevind: invoegings, delesies en puntmutasies. Maar met sommige oorerflike afwykings verskyn die ooreenstemmende simptome in reaksie op 'n verandering in die inhoud van sekere gene.
DankieKwantitatiewe analise gee 'n numeriese resultaat, meestal in IE / ml. Dit beteken dat in een milliliter van die toetsmonster 'n sekere aantal kopieë van die RNA of DNS van die patogeen, gemeet in internasionale eenhede, gevind is.
Afhangende van die omvang, word die erns van die infeksie gediagnoseer. Bloed word gewoonlik getoets om virale lading te bepaal, aangesien virusse vrylik in die bloed beweeg tydens siekte.
Kenmerke
Kwantitatiewe PCR in 'n bloedtoets het twee kenmerke.
- Die ontleding word uitgevoer in die teenwoordigheid van primers of deoksiribonukleosiedtrifosfate, wat met 'n fluoresserende of radioaktiewe etiket gemerk is om die inhoud van die gevormde PCR-produk akkuraat te bepaal.
- In die PCR-proses, beëindig die reaksie vroeg voordat te veel PCR-produkte verskyn. Dit is te wyte aan die feit dat in die finale stadium van versadiging, wanneer daar baie PCR-produkte is, beide die ensiem self en die substrate as die beperkende skakels van hierdie reaksie optree. Die einde van die volgende PKR-siklus onder sulke toestande word nie meer gekenmerk deur 'n verdubbeling van die aantal PKR-produkte nie, onbeduidende kwantitatiewe verskille tussen verskillende monsters word gelykgemaak, wat redelik duidelik gedefinieer word in die vroeë stadiums nadat hulle deur 'n reeks reaksiesiklusse gegaan het..
Koste van PCR-diagnostiek
PCR-navorsing het 'n koste, wat afhang van watter soort infeksie getoets gaan word, van die ontledingsmetodologie en die toetsmateriaal. Om een infeksie te bepaal, sal jy binne moet gee200-800 roebels. 'n Fooi vir die neem van biomateriaal word ook bygevoeg - ongeveer 400 roebels.
