Rekombinante DNA is molekules wat deur laboratoriumgenetiese rekombinasietegnieke gevorm word om genetiese materiaal van verskeie bronne te kombineer. Dit is moontlik omdat die DNA-molekules van alle organismes dieselfde chemiese struktuur het en slegs in die nukleotiedvolgorde daarin verskil.
Skepping
Molekulêre kloning is 'n laboratoriumproses wat gebruik word om rekombinante DNA te skep. Dit is een van die twee mees gebruikte metodes, saam met die polimerase kettingreaksie (PCR). Dit laat jou toe om die replikasie van enige spesifieke DNS-volgorde wat deur die eksperimenteer gekies is, te beheer.
Daar is twee fundamentele verskille tussen rekombinante DNA-metodes. Een daarvan is dat molekulêre kloning replikasie in 'n lewende sel behels, terwyl PCR in vitro behels. Nog 'n verskil is dat die eerste metode knip en plak van DNS-volgordes toelaat, terwyl die tweede verbeter word deur die bestaande volgorde te kopieer.
Vektor-DNA
Om rekombinante DNA te kry, vereis 'n kloningsvektor. Dit is afkomstig van plasmiede of virusse en is 'n relatief klein segment. Die keuse van vektor vir molekulêre kloning hang af van die keuse van gasheerorganisme, die grootte van die DNA wat gekloneer moet word, en of vreemde molekules uitgedruk moet word. Segmente kan gekombineer word deur verskeie metodes soos beperkingsensiem/ligase-kloning of Gibson-samestelling te gebruik.
Kloning
In standaardprotokolle behels kloning sewe stappe.
- Selekteer gasheerorganisme en kloningsvektor.
- Verkryging van 'n DNA-vektor.
- Vorming van gekloonde DNA.
- Skepping van rekombinante DNA.
- Invoering daarvan in die gasheerorganisme.
- Seleksie van organismes wat dit bevat.
- Seleksie van klone met gewenste DNS-insetsels en biologiese eienskappe.
Na oorplanting in die gasheerorganisme, kan die vreemde molekules wat in die rekombinante konstruk vervat is al dan nie uitgedruk word nie. Uitdrukking vereis herstrukturering van die geen om volgordes in te sluit wat nodig is vir DNA-produksie. Dit word deur die gasheer se vertaalmasjien gebruik.
Hoe dit werk
Rekombinante DNA werk wanneer die gasheersel 'n proteïen uit rekombinante gene uitdruk. Uitdrukking hang af van die omring van die geen met 'n stel seine wat instruksies vir sy transkripsie verskaf. Dit sluit promotor, ribosoombinding en terminator in.
Probleme ontstaan as die geenbevat introne of seine wat optree as terminators vir die bakteriese gasheer. Dit lei tot voortydige beëindiging. Die rekombinante proteïen kan onbehoorlik verwerk, gevou of afgebreek word. Die produksie daarvan in eukariotiese stelsels vind gewoonlik in giste en filamentagtige swamme plaas. Die gebruik van dierehokke is moeilik as gevolg van die behoefte aan 'n sterk ondersteunende oppervlak vir baie.
Eienskappe van organismes
Organismes wat rekombinante DNA-molekules bevat, het klaarblyklik normale fenotipes. Hul voorkoms, gedrag en metabolisme verander gewoonlik nie. Die enigste manier om die teenwoordigheid van rekombinante volgordes te demonstreer, is om die DNA self te ondersoek deur die polimerase kettingreaksietoets te gebruik.
In sommige gevalle kan rekombinante DNA skadelike effekte hê. Dit kan gebeur wanneer sy fragment wat 'n aktiewe promotor bevat langs 'n voorheen stil gasheerselgeen geleë is.
Gebruik
Rekombinante DNA-tegnologie word wyd gebruik in biotegnologie, medisyne en navorsing. Sy proteïene en ander produkte kan in byna elke Westerse apteek, veeartsenykliniek, dokterskantoor, mediese of biologiese laboratorium gevind word.
Die mees algemene toepassing is in basiese navorsing, waar tegnologie noodsaaklik is vir baie van vandag se werk in die biologiese en biomediese wetenskappe. Rekombinante DNA word gebruik om gene te identifiseer, te karteer en te volg, en om dit te bepaalfunksies. rDNA-probes word gebruik om geenuitdrukking in enkelselle en in weefsels van heel organismes te analiseer. Rekombinante proteïene word as reagense in laboratoriumeksperimente gebruik. Enkele spesifieke voorbeelde word hieronder gegee.
Rekombinante chymosin
Gevind in abomasum, chymosin is 'n ensiem wat nodig is om kaas te maak. Dit was die eerste geneties gemodifiseerde voedselbymiddel wat in die bedryf gebruik is. 'n Mikrobiologies vervaardigde rekombinante ensiem wat struktureel identies is aan 'n kalf-afgeleide ensiem is goedkoper en word in groter hoeveelhede geproduseer.
Rekombinante menslike insulien
Feitlik vervang insulien afkomstig van dierlike bronne (bv. varke en beeste) vir die behandeling van insulien-afhanklike diabetes. Rekombinante insulien word gesintetiseer deur die menslike insuliengeen in te bring in bakterieë van die genus Eterichia of gis.
Groeihormoon
Voorgeskryf vir pasiënte wie se pituïtêre klier nie genoeg groeihormoon produseer om normale ontwikkeling te ondersteun nie. Voordat rekombinante groeihormoon beskikbaar geword het, is dit verkry uit die pituïtêre klier van kadawers. Hierdie onveilige praktyk het daartoe gelei dat sommige pasiënte Creutzfeldt-Jakob-siekte ontwikkel het.
Rekombinante stollingsfaktor
Dit is 'n bloedstollingsproteïen wat toegedien word aan pasiënte met vorme van hemofilie met bloedingsversteurings. Hulle is nie in staat om te produseer niefaktor VIII in voldoende hoeveelhede. Voor die ontwikkeling van rekombinante faktor VIII, is die proteïen gemaak deur groot hoeveelhede menslike bloed van veelvuldige skenkers te verwerk. Dit het 'n baie hoë risiko ingehou om aansteeklike siektes oor te dra.
Diagnose van MIV-infeksie
Elkeen van die drie wyd gebruikte metodes vir die diagnose van MIV-infeksie is ontwikkel met behulp van rekombinante DNA.’n Teenliggaamtoets gebruik haar proteïen. Dit bespeur die teenwoordigheid van MIV-genetiese materiaal met behulp van omgekeerde transkripsie-polimerase-kettingreaksie. Die ontwikkeling van die toets is moontlik gemaak deur molekulêre kloning en volgordebepaling van die MIV-genome.
